产品货号:
LA11073
中文名称:
2×Pfu Master Mix
英文名称:
2x Pfu PCR Master Mix(no dye)
产品规格:
1mL|5×1mL
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品包含Pfu DNA Polymerase、dNTP以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增,具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可大限度的减少人为误差。扩增体系中加入的保护剂使得2×Pfu Master Mix反复冻融后仍可保持稳定活性。如需要含有电泳缓冲液和染料的版本,可参考本公司产品LA11074。Pfu DNA polymerase可以扩增较长的DNA片段,但大多数时候比较适合扩增5kb以下的片段,更长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。Pfu DNA Polymerase的PCR产物为平末端,可加A处理再与T-载体连接或使用平末端克隆载体。
组分 | 1mL | 5×1mL |
2×Pfu Master Mix | 1mL | 5×1mL |
说明书 | 1份 | 1份 |
保存:-20℃,避免反复冻融,有效期2年。
SDS-PAGE检测条带单一,经检测无外源核酸酶活性,PCR检测无宿主残余DNA,能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因。
- 操作注意事项
由于Pfu DNA Polymerase在室温下也有一定的反应活性,PCR反应体系请在冰上进行配制,之后再置于PCR仪上进行反应。这样可以减少在反应准备阶段发生的非特异扩增,有助于得到高特异性的扩增结果。 - 引物设计要点
- 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C;
- 引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配;
- 引物3’端应避免出现发夹结构;
- 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳,Tm值调整至55~65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算);
- 引物额外附加序列,即与模板非配对序列,不应参与引物Tm值计算;
- 引物的GC含量控制在40~60%之间;
- 引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀,避免使用GC或者AT含量高的区域;
- 避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列,两条引物的3’端避免3个碱基以上的互补序列;
- 引物设计完毕请使用NCBI BLAST功能检索引物特异性,以避免非特异性扩增产生。
- 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C;
- PCR反应体系
成分 用量 ddH2O 至50μL 2×Pfu Master Mix 25μL 模板DNA optional 引物1(10μM) 2μL 引物2(10μM) 2μL
注:50μL反应体系中不同模板的推荐使用量如下表。模板种类 扩增片段 基因组DNA 100ng~1μg 质粒DNA 10pg~20ng cDNA 1~5μL(不超过反应体系的1/10) - PCR扩增程序
循环步骤 温度 时间 循环数 预变性 94℃ 30sec~3min 1 变性 94℃ 20~30sec 30-35 退火 55℃ 30sec 延伸 72℃ 0.5kb/min 终延伸 72℃ 5~10min 1
注:- 预变性温度和时间:推荐使用94℃;对于高GC模板,推荐变性温度为98℃。预变性推荐时间:质粒DNA等简单模板为30sec;cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min。
- 退火温度和时间:可根据需要,设立温度梯度去摸索引物退火的最适温度。推荐退火时间设置为20sec,可以在10~30sec内调节。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈弥散状。
- 扩增产物:请将PCR扩增产物放置于-20℃保存,防止DNA发生降解。
- 预变性温度和时间:推荐使用94℃;对于高GC模板,推荐变性温度为98℃。预变性推荐时间:质粒DNA等简单模板为30sec;cDNA、基因组DNA等复杂模板为3min。
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